中瑞祥分光光度計儀器組成以及原理

儀器組成

分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

原理

分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度；

I0為入射的單色光強度；

I 為透射的單色光強度；

T 為物質的透射率；

k 為摩爾吸收系數；

L 為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；

c 為物質的濃度；

物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或對照品同時操作。

常見用途

核酸的定量

核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。